LBA4404電擊感受態(tài)細胞 ,根癌農(nóng)桿菌電擊感受態(tài)
| 別名: | |||
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| Cas號: | 物化性質: | ||
| 分子式: | 熔點: | ||
| 分子量: | 沸點: | ||
| EINECS編號: | 密度: | ||
| MDL號: | 儲存條件: | ||
LBA4404 Elec： 50μl/支
pCAMBIA2301（control vector，10ng/μl ) 10μl
保存條件(保質期)： -80℃（12個月）
基因型
Ach5 (rifR) Ti pAL4404 (strepR) Octopine
產(chǎn)品說明
LBA4404菌株為Ach5型背景，核基因中含有篩選標簽——利福平抗性基因rif，為了便于轉化操作，此菌株攜帶一無自身轉運功能的章魚堿型Ti質粒pAL4404，此質粒含有vir基因 (vir基因是T-DNA插入植物基因組必需的元件，pAL4404質粒自身的T-DNA轉移功能被破壞，但可以幫助轉入的雙元載體T-DNA順利轉移)。 pAL4404型Ti質粒含有篩選標簽：strep，賦予LBA4404菌株鏈霉素抗性，適用于菸草、番茄、煙草等植物的轉基因操作。本公司的LBA4404電轉感受態(tài)特別適用于大質粒的轉化：經(jīng)pCAMBIA2301質粒 (size:11633 bp)檢測轉化效率>105 cfu/μg DNA；經(jīng)pCAMBIA2301-ZH質粒 (size:40 kb)檢測轉化效率可達103 cfu/μg DNA。
操作方法
1. 0.1 cm電擊杯和杯蓋從儲存液中拿出倒置于干凈的吸水紙上5分鐘，待其瀝干水分，正置5分鐘，使乙醇充分揮發(fā)，待乙醇揮發(fā)干凈立即插入冰中，壓實冰面，電極杯頂離冰面0.5 cm以方便蓋上杯蓋，冰中靜置5分鐘充分降溫。
2. 取-80℃保存的農(nóng)桿菌感受態(tài)插入冰中5分鐘，待其融化，加入0.01-1 μg質粒DNA（體積不大于6ul，感受態(tài)轉化效率較高，第一次使用前最好做預實驗確定所加質粒的量），用手撥打管底混勻，立即插入冰中，用200 μl槍頭將感受態(tài)-質粒混合物快速移到電擊杯中，蓋上杯蓋，空管保留待用。
3. 啟動電轉儀，設置參數(shù)：C=25 μF，PC=200 ohm，V=2400 V（此參數(shù)為Biorad 推薦，使用者也可按所用電轉儀推薦的protocol操作），將電擊杯快速放入電轉槽中，電擊完成快速插入冰中，加入700 μl無抗生素的LB并轉移到感受態(tài)空管中，28℃振蕩培養(yǎng)2~3小時。
4. 6000 rpm離心一分鐘收菌，留取100 μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊涂布于含相應抗生素的LB或YEB平板上，倒置放于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2-3天
（當平板只含有50 μg/ml kan 時，28℃培養(yǎng)48 h即可；平板中同時加入50 μg/ml kan，20 μg/ml rif 時，需28℃培養(yǎng)60 h；如果使用的平板含有50 μg/ml rif 則需要28℃培養(yǎng)72-90 h）。
備注
1、農(nóng)桿菌相關抗生素配方：
2、常用農(nóng)桿菌抗性：（R：抗；S：敏感。）
3、LB及YEB配方：
注意事項
1. 加入質粒時體積不應大于感受態(tài)體積的1/10；質粒不純或存在乙醇等有機物污染，轉化效率急劇下降；質粒增大一倍，轉化效率下降一個數(shù)量級。
2. 混入質粒時應輕柔操作。轉化高濃度的質粒可相應減少最終用于涂板的菌量。
3. 平板上陽性克隆密度過大時，由于營養(yǎng)不足，陽性克隆生長變慢，菌落變小，為了獲得大的菌落，應減少質粒用量。
4. 利福平濃度不應高于25 μg/ml，過高的利福平濃度不利于農(nóng)桿菌生長，會降低其生長速度和轉化效率。本公司感受態(tài)計算轉化效率時所用平板只含有50 μg/ml kan，若所用平板含有20 μg/ml rif則轉化效率降低到1/2。
5. 培養(yǎng)基中加入利福平的目的是防止雜菌生長、篩選農(nóng)桿菌；根據(jù)所用菌株抗性加入Ti質粒篩選抗生素可防止Ti質粒丟失，但Ti質粒篩選抗生素不利于農(nóng)桿菌的轉基因操作，所以一般培養(yǎng)農(nóng)桿菌時不考慮這些抗生素，Ti質粒丟失的概率極低(可以忽略)。
pCAMBIA2301（control vector，10ng/μl ) 10μl
保存條件(保質期)： -80℃（12個月）
基因型
Ach5 (rifR) Ti pAL4404 (strepR) Octopine
產(chǎn)品說明
LBA4404菌株為Ach5型背景，核基因中含有篩選標簽——利福平抗性基因rif，為了便于轉化操作，此菌株攜帶一無自身轉運功能的章魚堿型Ti質粒pAL4404，此質粒含有vir基因 (vir基因是T-DNA插入植物基因組必需的元件，pAL4404質粒自身的T-DNA轉移功能被破壞，但可以幫助轉入的雙元載體T-DNA順利轉移)。 pAL4404型Ti質粒含有篩選標簽：strep，賦予LBA4404菌株鏈霉素抗性，適用于菸草、番茄、煙草等植物的轉基因操作。本公司的LBA4404電轉感受態(tài)特別適用于大質粒的轉化：經(jīng)pCAMBIA2301質粒 (size:11633 bp)檢測轉化效率>105 cfu/μg DNA；經(jīng)pCAMBIA2301-ZH質粒 (size:40 kb)檢測轉化效率可達103 cfu/μg DNA。
操作方法
1. 0.1 cm電擊杯和杯蓋從儲存液中拿出倒置于干凈的吸水紙上5分鐘，待其瀝干水分，正置5分鐘，使乙醇充分揮發(fā)，待乙醇揮發(fā)干凈立即插入冰中，壓實冰面，電極杯頂離冰面0.5 cm以方便蓋上杯蓋，冰中靜置5分鐘充分降溫。
2. 取-80℃保存的農(nóng)桿菌感受態(tài)插入冰中5分鐘，待其融化，加入0.01-1 μg質粒DNA（體積不大于6ul，感受態(tài)轉化效率較高，第一次使用前最好做預實驗確定所加質粒的量），用手撥打管底混勻，立即插入冰中，用200 μl槍頭將感受態(tài)-質粒混合物快速移到電擊杯中，蓋上杯蓋，空管保留待用。
3. 啟動電轉儀，設置參數(shù)：C=25 μF，PC=200 ohm，V=2400 V（此參數(shù)為Biorad 推薦，使用者也可按所用電轉儀推薦的protocol操作），將電擊杯快速放入電轉槽中，電擊完成快速插入冰中，加入700 μl無抗生素的LB并轉移到感受態(tài)空管中，28℃振蕩培養(yǎng)2~3小時。
4. 6000 rpm離心一分鐘收菌，留取100 μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊涂布于含相應抗生素的LB或YEB平板上，倒置放于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2-3天
（當平板只含有50 μg/ml kan 時，28℃培養(yǎng)48 h即可；平板中同時加入50 μg/ml kan，20 μg/ml rif 時，需28℃培養(yǎng)60 h；如果使用的平板含有50 μg/ml rif 則需要28℃培養(yǎng)72-90 h）。
備注
1、農(nóng)桿菌相關抗生素配方：
| 抗生素 | 配方 | 原液 | 工作液 |
| 羧芐青霉素（carb） | 雙蒸水溶解，0.22 μm濾膜過濾除菌 | 50 mg/ml | 50 μg/ml |
| 硫酸卡那霉素（kan） | 雙蒸水溶解，0.22 μm濾膜過濾除菌 | 50 mg/ml | 50 μg/ml |
| 鏈霉素（strep） | 雙蒸水溶解，0.22 μm濾膜過濾除菌 | 10 mg/ml | 50 μg/ml |
| 利福平（rif） | DMSO溶解，0.22 μm濾膜過濾除菌 | 10 mg/ml | 20 μg/ml |
| 慶大霉素（gent） | 雙蒸水溶解，0.22 μm濾膜過濾除菌 | 20 mg/ml | 40 μg/ml |
2、常用農(nóng)桿菌抗性：（R：抗；S：敏感。）
| 農(nóng)桿菌菌株 | 羧芐青霉素(carb) | 鏈霉素(strep) | 利福平(rif) | 慶大霉素(gent) | 硫酸卡那霉素(kan) |
| AGL-1 | R | S | R | S | S |
| EHA101 | S | S | R | S | R |
| EHA105 | S | S | R | S | S |
| LBA4404 | S | R | R | S | S |
| GV3101 | S | S | R | R | S
|
3、LB及YEB配方：
| component | LB(液體)/L | LB(固體)/L | component | YEB(液體)/L | YEB(固體)/L |
| Tryptone | 10 g | 10 g | Tryptone | 5 g | 5 g |
| Yeast extract | 5 g | 5 g | Yeast extract | 1 g | 1 g |
| NaCl | 10 g | 10 g | 牛肉浸膏 | 5 g | 5 g |
| NaOH | 調PH到7.0 | 調PH到7.0 | 蔗糖 | 5 g | 5 g |
| Agar | － | 15 g | MgSO4*7H2O | 0.49 g | 0.49 g |
| NaOH | 調PH到7.0 | 調PH到7.0 | |||
| Agar | － | 15 g |
注意事項
1. 加入質粒時體積不應大于感受態(tài)體積的1/10；質粒不純或存在乙醇等有機物污染，轉化效率急劇下降；質粒增大一倍，轉化效率下降一個數(shù)量級。
2. 混入質粒時應輕柔操作。轉化高濃度的質粒可相應減少最終用于涂板的菌量。
3. 平板上陽性克隆密度過大時，由于營養(yǎng)不足，陽性克隆生長變慢，菌落變小，為了獲得大的菌落，應減少質粒用量。
4. 利福平濃度不應高于25 μg/ml，過高的利福平濃度不利于農(nóng)桿菌生長，會降低其生長速度和轉化效率。本公司感受態(tài)計算轉化效率時所用平板只含有50 μg/ml kan，若所用平板含有20 μg/ml rif則轉化效率降低到1/2。
5. 培養(yǎng)基中加入利福平的目的是防止雜菌生長、篩選農(nóng)桿菌；根據(jù)所用菌株抗性加入Ti質粒篩選抗生素可防止Ti質粒丟失，但Ti質粒篩選抗生素不利于農(nóng)桿菌的轉基因操作，所以一般培養(yǎng)農(nóng)桿菌時不考慮這些抗生素，Ti質粒丟失的概率極低(可以忽略)。
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LBA4404電擊感受態(tài)細胞
