EHA101 Elec：                                                            50μl/支
pK7WGF2（control vector，10ng/μl )                            10μl
保存條件(保質期)：                                         -80℃（12個月）
基因型
C58 (rif^R) Ti pEHA101 (pTiBo542 D T-DNA) (kan^R) Nopaline
產品說明
EHA101菌株為C58型背景，核基因中含有篩選標簽——利福平抗性基因rif，為了便于轉化操作，此菌株攜帶一無自身轉運功能的胭脂堿型Ti質粒pEHA101 (pTiBo542DT-DNA)，此質粒含有vir基因 (vir基因是T-DNA插入植物基因組必需的元件，pEHA101 (pTiBo542DT-DNA)質粒自身的T-DNA轉移功能被破壞，但可以幫助轉入的雙元載體T-DNA順利轉移)。pEHA101 (pTiBo542DT-DNA) 型Ti質粒含有篩選標簽：kan，賦予EHA101菌株卡那霉素抗性，適用于玉米、水稻、煙草等植物的轉基因操作。本公司的EHA101電轉感受態特別適用于大質粒的轉化：經pK7WGF2質粒 (壯觀霉素抗性，size:11876 bp)檢測轉化效率>10⁵ cfu/μg DNA；經pK7WGF2-ZH質粒（size:40 kb）檢測轉化效率可達5×10³ cfu/μg DNA。。
操作方法
1. 0.1 cm電擊杯和杯蓋從儲存液中拿出倒置于干凈的吸水紙上5分鐘，待其瀝干水分，正置5分鐘，使乙醇充分揮發，待乙醇揮發干凈立即插入冰中，壓實冰面，電極杯頂離冰面0.5 cm以方便蓋上杯蓋，冰中靜置5分鐘充分降溫。
2. 取-80℃保存的農桿菌感受態插入冰中5分鐘，待其融化，加入0.01-1 μg質粒DNA（體積不大于6ul，感受態轉化效率較高，第一次使用前最好做預實驗確定所加質粒的量），用手撥打管底混勻，立即插入冰中，用200 μl槍頭將感受態-質?；旌衔锟焖僖频诫姄舯校w上杯蓋，空管保留待用。
3. 啟動電轉儀，設置參數：C=25 μF，PC=200 ohm，V=2400 V（此參數為Biorad 推薦，使用者也可按所用電轉儀推薦的protocol操作），將電擊杯快速放入電轉槽中，電擊完成快速插入冰中，加入700 μl無抗生素的LB并轉移到感受態空管中，28℃振蕩培養2~3小時。
4. 6000 rpm離心一分鐘收菌，留取100 μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊涂布于含相應抗生素的LB或YEB平板上，倒置放于28℃培養箱培養2-3天
（當平板只含有轉化所用雙元載體抗生素時，28℃培養48小時即可；平板中同時加入雙元載體抗生素，20 μg/ml rif 時，需28℃培養60小時；如果使用的平板含有50 μg/ml rif 則需要28℃培養72-90小時）。
備注
1、農桿菌相關抗生素配方：

抗生素	配方	原液	工作液
羧芐青霉素（carb）	雙蒸水溶解，0.22 μm濾膜過濾除菌	50 mg/ml	50 μg/ml
硫酸卡那霉素（kan）	雙蒸水溶解，0.22 μm濾膜過濾除菌	50 mg/ml	50 μg/ml
鏈霉素（strep）	雙蒸水溶解，0.22 μm濾膜過濾除菌	10 mg/ml	50 μg/ml
利福平（rif）	DMSO溶解，0.22 μm濾膜過濾除菌	10 mg/ml	20 μg/ml
慶大霉素（gent）	雙蒸水溶解，0.22 μm濾膜過濾除菌	20 mg/ml	40 μg/ml

 
2、常用農桿菌抗性：（R：抗；S：敏感。）

農桿菌菌株	羧芐青霉素(carb)	鏈霉素(strep)	利福平(rif)	慶大霉素(gent)	硫酸卡那霉素(kan)
AGL-1	R	S	R	S	S
EHA101	S	S	R	S	R
EHA105	S	S	R	S	S
LBA4404	S	R	R	S	S
GV3101	S	S	R	R	S

3、LB及YEB配方：

component	LB(液體)/L	LB(固體)/L	component	YEB(液體)/L	YEB(固體)/L
Tryptone	10 g	10 g	Tryptone	5 g	5 g
Yeast extract	5 g	5 g	Yeast extract	1 g	1 g
NaCl	10 g	10 g	牛肉浸膏	5 g	5 g
NaOH	調PH到7.0	調PH到7.0	蔗糖	5 g	5 g
Agar	－	15 g	MgSO4*7H2O	0.49 g	0.49 g
			NaOH	調PH到7.0	調PH到7.0
			Agar	－	15 g

注意事項
1. 加入質粒時體積不應大于感受態體積的1/10；質粒不純或存在乙醇等有機物污染，轉化效率急劇下降；質粒增大一倍，轉化效率下降一個數量級。
2. 混入質粒時應輕柔操作。轉化高濃度的質?？上鄳獪p少最終用于涂板的菌量。
3. 平板上陽性克隆密度過大時，由于營養不足，陽性克隆生長變慢，菌落變小，為了獲得大的菌落，應減少質粒用量。
4. 利福平濃度不應高于25 μg/ml，過高的利福平濃度不利于農桿菌生長，會降低其生長速度和轉化效率。本公司感受態計算轉化效率時所用平板只含有50 μg/ml kan，若所用平板含有20 μg/ml rif則轉化效率降低到1/2。
5. 培養基中加入利福平的目的是防止雜菌生長、篩選農桿菌；根據所用菌株抗性加入Ti質粒篩選抗生素可防止Ti質粒丟失，但Ti質粒篩選抗生素不利于農桿菌的轉基因操作，所以一般培養農桿菌時不考慮這些抗生素，Ti質粒丟失的概率極低(可以忽略)。